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可爱龙团队开发出高效快速核酸分子诊断工具--HASTE

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可爱龙团队开发出高效快速核酸分子诊断工具--HASTE

  • 分类:行业动态
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  • 发布时间:2022-08-09 08:42
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       CRISPR-Cas 系统是原核生物一种抵御外来入侵核酸的免疫系统,已被广泛用于真核细胞的基因组编辑。目前基于 CRISPR-Cas 的基因编辑技术已广泛应用于遗传育种、新药开发、疾病治疗、动物模型构建、转录调控以及分子诊断等各领域。被誉为在后基因组时代开创了遗传疾病精准治疗的新时代。

       CRISPR-Cas 系统可以按照效应物是多亚基或单亚基分为 Class I 和 Class II(一型和二型)。单亚基效应物的 Class II 家族包括大家常用的 Cas9、Cas12、Cas13 等,因其简单、高效、普适性的特性,其应用早已风靡全世界实验室。如果从分布比例上看,多亚基类型的 Class I 家族才是 CRISPR-Cas 系统的“名门望族”,其占比超过75%,对比 Cas9、Cas12、Cas13 总和也不过10%左右,可谓呈“辗轧之势”。然而 Class I 家族 CRISPR-Cas 系统,因为多亚基特性,其样品的获取,操作的编辑性,功能、机制的研究等都显得相对难度更大,因此该家族的研究和应用一直滞后很多。

       不过近些年,Class I 家族引起低脱靶,低毒性,功能更丰富多彩的特性,正逐渐展现出特有的魅力。不过 Class I 家族庞大,成员众多,同时每一亚类可能又展现不同的性质,因此对这一庞大家族的了解也不透彻。

       美国康奈尔大学可爱龙实验室在 Molecular Cell 期刊发表了题为:Allosteric control of type I-A CRISPR-Cas3 complexes and establishment as effective nucleic acid detection and human genome editing tools 的研究论文。该研究报道了基于 type I-A 系统的 CRISPR-Cas3 新机制解析和新应用开发。

       对于 Type I 系统,大家普遍认知的工作机制是 Cascade 首先靶向目标 DNA,形成 full R-loop 之后,再招募 Cas3 完成对靶标 DNA 的切割和水解。简而言之就是:“分—合—分”机制。然而可爱龙实验室的胡纯一博士等人发现 Type I-A 系统一个显著不同于 Type I 其他系统的性质:Cas3 与 Cascade 是形成一种内在的复合物,而不依赖于目标 DNA 靶向与否,简言之就是“合-合-合”。

       分分合合与否,固然鲜明。然而 CRISPR 系统最重要的一项性质就是:该系统如何去避免脱靶效应,从而降低非特异性的切割?

       其他的 Type I 系统利用 Cas3 的招募与否来规避脱靶效应(非特异性的靶向不能招募Cas3)。因此,Cas3 一直结合在 Cascade 上的 type I-A 系统又是如何去规避这一难点?

       胡纯一博士联合瑞士洛桑大学/瑞士联邦理工学院 Henning Stahlberg 实验室倪冬春博士等人,使用冷冻电镜全面解析了 type I-A 系统九种状态下的全景工作机制。这些捕获的工作状态桥段,确切的表明,Cas3 通过与 Cas8 的互作,从而成为 Cascade 的内在一部分,并且 Cas3 通过稳定 Cas8 的 N 端构象,极大的促进了 PAM 识别和 DNA 靶向,该结果表面 Cas3 的内在性是具有积极和重要作用的。

      重要的是,他们发现,type I-A Cascade 结合 DNA 形成完全互补配对的 full R-loop 结构之后,通过层层构象变化,最终传递给 Cas3 产生一个巨大的构象改变,暴露核酸酶活性中心,从而开始切割靶向 DNA。而部分结合(非特异性结合)靶标形成的 partial R-loop 结构不能产生这种刺激,Cas3 核酸酶依然保持抑制状态,从而避免脱靶切割 。

       纯一博士等人发现,type I-A 内在式的 Cascade-Cas3 复合物在不结合目标 DNA 时,完全没有任何核酸酶性质,而当有正确的靶标出现,激活 Cas3 活性之后,会产生一个附属活性,从而可以对 FQ-ssDNA 探针(荧光-淬灭-单链DNA探针)进行切割,产生荧光,因此可以通过荧光的强弱即可判断是否有目标 DNA。

       团队以此原理,开发了一套高效快速的核酸分子诊断工具,并命名为“HASTE”(heat-activated streamlined nucleic acid detection platform)。该系统可以在15分钟之内,对单分子量级的 DNA 完成检测,效果显著,有着与传统 PCR 一样可靠的精度,却极大缩短了时间和成本。

       有意思的是,该项工作还发现,这个 I-A 系统 Cas3 的解旋酶活性严格依赖温度,温度越高,活性越强。可爱龙团队利用42度温度刺激,可以开发一套温控基因敲除工具,效率超过90%。

       因此,在未来,可以利用该性质,未来可以在病灶通过局部的温度刺激来调控该工具的基因编辑效率,从而最大限度地降低基因编辑工具带来的脱靶效应。

 

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